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   化妝品的刺激性是消費(fèi)者們?cè)谫?gòu)買(mǎi)產(chǎn)品時(shí)最為關(guān)注的方面之一，畢竟大家都希望在使用化妝品后能改善皮膚狀態(tài)而不是“爛臉”。

我國(guó)的法規(guī)對(duì)這一方面也十分重視，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015版）》中“毒理學(xué)試驗(yàn)方法”部分對(duì)化妝品原料及其產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的毒理學(xué)檢測(cè)做出規(guī)定，要求化妝品新原料需進(jìn)行刺激性實(shí)驗(yàn)。刺激性實(shí)驗(yàn)包括皮膚和急性眼刺激性/腐蝕性實(shí)驗(yàn)，《規(guī)范》中所規(guī)定的兩種實(shí)驗(yàn)均為在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

但近年來(lái)，以歐盟為首的全球眾多國(guó)家和地區(qū)正呼吁禁止在化妝品安全評(píng)價(jià)中使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，這使得開(kāi)發(fā)替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體外化妝品刺激性評(píng)價(jià)方法成為未來(lái)的趨勢(shì)。目前，歐洲替代方法驗(yàn)證中心（ECVAM, European Centre for the Validation of Alternative Methods）已經(jīng)驗(yàn)證了多種滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則的化妝品體外皮膚/眼球刺激性的評(píng)價(jià)方法。

眼球刺激性/腐蝕性評(píng)價(jià)

1 牛角膜透明度和透氣性試驗(yàn)（BCOP）

BCOP法是利用離體牛角膜與受試物直接接觸，若受試物具有刺激性則會(huì)導(dǎo)致牛角膜上皮屏障功能破損和基質(zhì)蛋白變性。

該方法將牛角膜的透明度和透氣性作為毒理學(xué)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)公式計(jì)算與兩個(gè)指標(biāo)數(shù)值相關(guān)的體外刺激分?jǐn)?shù)（In Vitro Irritancy Score，IVIS），通過(guò)評(píng)分進(jìn)行分類(lèi)：若IVIS > 55，則受試物具有嚴(yán)重眼刺激性；若IVIS ≤ 3，則無(wú)刺激性；若3＜IVIS ≤ 55，則無(wú)法判斷，需結(jié)合其他替代方法進(jìn)一步測(cè)試。

BCOP法可用于分辨眼刺激性的有無(wú)，但無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分輕微、中等刺激，且無(wú)法區(qū)分嚴(yán)重眼刺激與眼損傷，該方法不受樣品劑型、溶解性的限制。

2 離體雞眼試驗(yàn)（ICE）

ICE法是利用短期離體培養(yǎng)的雞眼球進(jìn)行眼刺激性試驗(yàn)的方法。

取雞眼球固定于夾持器，暴露受試物，通過(guò)肉眼檢查、測(cè)量角膜厚度、表面灌流和熒光素滲透，將角膜渾濁度、角膜膨脹度和熒光素滯留度的數(shù)值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)三個(gè)評(píng)價(jià)維度進(jìn)行ICE分類(lèi)，每個(gè)維度包括I、II、III、IV四個(gè)等級(jí)，最后通過(guò)三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的終點(diǎn)組合分析：若終點(diǎn)組合為3×I或2×I+1×II，則無(wú)刺激性；若終點(diǎn)組合為3×IV、2×IV+1×Ⅲ、2×IV+1×II、2×IV+1×IV、30 min時(shí)角膜渾濁度≥3（至少兩只眼球）、任何時(shí)間點(diǎn)角膜渾濁度= 4（至少2只眼球）、上皮嚴(yán)重松弛（至少1只眼球），則有嚴(yán)重眼損傷和眼腐蝕；若為其他情況，則無(wú)法判斷。

ICE法可用于鑒別化學(xué)物的眼腐蝕和嚴(yán)重眼損傷或無(wú)刺激性，但無(wú)法區(qū)分嚴(yán)重眼刺激、眼損傷。該方法適用于固體、液體、乳劑、凝膠狀化合物。

3 短期暴露試驗(yàn)（STE）

STE法利用兔眼角膜細(xì)胞（SIRC），將受試物短期暴露5min，使用MTT法或CCK-8法測(cè)定細(xì)胞吸光度，通過(guò)計(jì)算受試物暴露后引起角膜上皮的細(xì)胞生存率判斷受試物的眼刺激性。

若受試物5%和0.05%質(zhì)量比濃度引起細(xì)胞生存率≤70%，則該受試物有刺激性；反之，若受試物5%和0.05%質(zhì)量比濃度引起細(xì)胞生存率＞70%，則無(wú)眼刺激性。

4 重組人角膜上皮模型試驗(yàn)（RhCE）

RhCE模型是將來(lái)源于正常人的表皮角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)于特殊制備的嵌入式細(xì)胞培養(yǎng)板中，通過(guò)培養(yǎng)，細(xì)胞分化形成多層結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)建與角膜上皮非常相似的三維模型，目前 EpiOcularTMEIT是唯一已獲得OECD指南驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)模型。

受試物暴露于類(lèi)似角膜上皮模型一定時(shí)間后，使用MTT法計(jì)算細(xì)胞吸光度，通過(guò)計(jì)算受試物暴露后引起角膜上皮的細(xì)胞生存率判斷受試物的眼刺激性。若細(xì)胞存活率＞60%，則無(wú)刺激；若存活率≤ 60%，代表有刺激，但無(wú)法區(qū)分嚴(yán)重眼損傷或眼刺激，也無(wú)法對(duì)眼刺激進(jìn)一步分類(lèi)，此時(shí)需要使用其他方法進(jìn)一步判斷。

5 雞胚絨毛-尿囊膜試驗(yàn)（HET-CAM）

9日齡雞胚（CAM）開(kāi)始試驗(yàn)。用牙科彎鑷小心剝?nèi)馐业皻げ糠?，在蛋殼膜表面滴幾滴生理鹽水使充分潤(rùn)濕，傾出后，用鑷子小心除去蛋殼膜，保證暴露的尿素膜完整不受任何損傷。取0.3mL/0.3g受試物直接作用于CAM。盡量涂布開(kāi)，確保覆蓋面積達(dá)到至少50%。作用3min后，用純水輕輕沖洗CAM表面，在30s內(nèi)沖洗完成，傾出液體，立即在體視鏡下觀察每種毒性效應(yīng)變化程度，給予評(píng)分（ES）。

若ES≤12，則評(píng)價(jià)為無(wú)眼刺激性或輕度眼刺激性；若12＜ES＜16，則評(píng)價(jià)為中度眼刺激性；若ES≥16，則評(píng)價(jià)為嚴(yán)重眼刺激性。

該方法適用于多種類(lèi)型液體原料和產(chǎn)品，對(duì)固體、不溶性、黏稠性物質(zhì)的重復(fù)性差，慎用于色素和染料的測(cè)試，主要適用于無(wú)刺激到輕度刺激物的預(yù)測(cè)。

皮膚刺激性/腐蝕性評(píng)價(jià)

1 重組人表皮模型試驗(yàn)（RHE）

RHE試驗(yàn)是通過(guò)培養(yǎng)未分化的人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，重組三維人體表皮的模型。

常見(jiàn)的皮膚刺激性評(píng)價(jià)模型有EpiSkin、EpiDermTM、SkinEthicTM、LabCyte EPI-MODEL24 SIT；皮膚腐蝕性評(píng)價(jià)模型有EpiskinTM、EpiDermTMSCT、SkinEthinTMRHE和epiCS。

該方法將受試物直接與模型接觸一定的時(shí)間后，使用MTT法測(cè)試細(xì)胞毒性，不同的模型有其相應(yīng)的判斷指標(biāo)。

下面對(duì)其中一種皮膚腐蝕性的EpiskinTM模型進(jìn)行介紹。該模型主要通過(guò)細(xì)胞存活率進(jìn)行判斷：當(dāng)受試物暴露3min 后，若細(xì)胞存活率<35%，則有腐蝕性，腐蝕性強(qiáng)度為1A；若暴露3 min后，存活率≥35%且暴露60 min后，存活率＜35%，則有腐蝕性，腐蝕性強(qiáng)度為1B和1C；若暴露240min后，存活率≥35%，則無(wú)腐蝕性。該方法不僅可用于鑒別物質(zhì)是否具有腐蝕性，且可以對(duì)腐蝕性強(qiáng)度 1A、1B和1C 進(jìn)一步分類(lèi)，但無(wú)法區(qū)分1B、1C。受試物可以為固態(tài)、半固態(tài)、液體和蠟狀。

2 體外經(jīng)皮電阻試驗(yàn)（TER）

將待測(cè)的化學(xué)物質(zhì)暴露于離體的大鼠皮膚表面，具有腐蝕性的受試物可破壞表皮角質(zhì)層，使通過(guò)皮片的電阻值（TER）明顯降低。若經(jīng)皮電阻值＞5 kΩ，則受試物無(wú)腐蝕性；若經(jīng)皮電阻≤5 kΩ，而且該受試物不是表面活性物質(zhì)或中性有機(jī)溶劑，評(píng)定受試物具有腐蝕性；如果受試物為表面活性物質(zhì)或中性有機(jī)溶劑，經(jīng)皮電阻≤5 kΩ，可增加硫丹明B染色劑穿透試驗(yàn)，以確定是否出現(xiàn)假陽(yáng)性。

TER試驗(yàn)與人體皮膚模型試驗(yàn)相比具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和對(duì)試驗(yàn)條件要求不苛刻的優(yōu)點(diǎn)。

最后，用表格對(duì)上述知識(shí)點(diǎn)再進(jìn)行一次總結(jié)，要多多復(fù)習(xí)。